유전체란? 유전체 염기서열 분석기술 DNA, RNA, 단백질 분석 방법- 생어 염기서열 분석 차세대 염기서열 분석법NGS 중합효소 연쇄 반응

유전체란? 유전체 염기서열 분석기술 DNA, RNA, 단백질 분석 방법

- 생어 염기서열 분석 차세대 염기서열 분석법(NGS)  중합효소 연쇄 반응

동물유전과개량 DNA 분석방법

 

 

 

DNA, RNA, 단백질 분석 방법 전개

 

유전체란?

게놈genome을 말한다.

한 생물이 가지는 모든 유전 정보를 유전체라고 한다. 생물의 유전형질을 결정짓는 유전정보의 총합을 말한다. 일부 바이러스의 RNA를 제외하고 모든 생물은 DNA로 유전 정보를 구성하고 있기 때문에 일반적으로 DNA로 구성된 유전 정보를 지칭한다.

게놈이라는 단어는 독일 함부르크 대학의 식물학자 윙클러(H. Winkler)가 1920년에 처음 만들었다. 그는 유전자(gene)와 염색체(chromosome)를 합쳐 게놈이라는 단어를 창안했으며 이 때의 개념은 배우자(配偶子: gamete), 즉 동물의 경우에는 정자나 난자가 가지는 염색체 전체를 가리키는 것이었다. 이후 1930년에 기하라 히토시(木原均)가 기능적인 의미를 추가하여, 생물이 생물로서 존재하기 위해 필요한 온전한 유전 정보로 게놈을 재정의했다. 그렇기 때문에 현재는 일반적인 생물의 체세포 내에 들어있는 염색체 중 반수체(半數體: haploid), 즉 2n의 상 중 n에 포함된 유전 정보를 의미하는 용어로 이용된다.

유전체는 DNA분자로 구성되어 있는 총합체로 유전체는 생명현상의 전반을 지배하는 정보의 저장고이자 명령본부로서의 역할을 수행한다.

생명체는 세포로 이루어져 있는데, 세포내에 있는 핵내에 핵 유전체가 존재하고,

유전체는 중요한 정보를 가지고 있기 때문에 세포안에서도 핵막과 미토콘드리아막속에 이중으로 존재한다

유전체 관련연구는 1866년 멘델이후 많은 발전을 이루어왔다. 소위 유전학이라는 범주가 만들어진 것이다. 1910년 초파리실험을 통하여 유전자 지도(연관 지도)가 작성되면서 획기적인 발전을 이루어왔으며, 그 이후 1953년에 실제 유전물질은 DNA라는 것이 입증이 되었다. 1990년에 미국을 중심으로 인간의 유전체 해독 프로젝트연구가 시작되면서, 마우스, 선충 등의 동물 유전체가 해독되었고, 2003년에는 인간 유전체 해독이 거의 마무리 단계에 들어갔다는 보고서가 발간되었다. 이후

휴먼 게놈 프로젝트는 괄목할 정도 발전이 이루어졌다. 2004년 닭에서부터 시작하여 2005년에는 개, 2009년에는 소와 말, 2010년에는 칠면조, 2012년에는 돼지, 2013년에는 오리, 염소 등 가축을 포함한 여러 동물의 유전체 해독이 이루어지면서, 관련기술과 기법이 많은 발전을 해왔다.

지금은 차세대 염기서열 결정법NGS next generation sequencing의 급속한 발전으로 유전체 분석에 필요한 시간과 비용이 감소되었다. 인간의 유전체 해독에 필요한 시간과 비용이 2001년에 10년, 1억달러에서 2007년에는 2주, 1천달러로 비용과 시간이 단축되었다. 이러한 기술발전과 더불어서 인간 유전체의 구성부분이 완전 해독되어지면서 인간 유전체 해독 구성부분이 계속 새롭게 발표되어왔다.

인간 유전체의 유전자 즉, 기능을 갖고 있는 유전자 부분은 전체 32억개 DNA중에 1.5%의 비율만이 단백질을 만들어 내고, 나머지 98%는 의미가 불분명한 DNA로 구성되어 있음이 밝혀졌다. 이러한 불분명한 DNA들은 단백질을 만들어 내지 않는 트랜스포존, 점핑유전자로 알려져 이처럼 DNA는 다양한 종류의 유전자 변이가 있음을 알게 되었다.

 

 

 

유전체 분석 기술

 

대용량 유전체 분석기술

생명현상에 관여하는 유전자는 한 두 가지에 한정되지 않는다. 때문에 기존의 방법으로는 한계가 있어 고안된 방법이 마이크로어레이microarray를 이용한 대량 유전체 분석 기술이다. 수천, 수만 개의 DNA나 단백질 등을 일정한 건격으로 배열하고, 분석대상 물질을 처리하여 그 결합양상을 분석할 수 있는 바이오칩biochip(고밀도DNA분자 arry)을 말하며 DNA칩, 단백질 칩 등이 대표적이다. 최초에는 나이론막을 이용하여 유전자나 단백질의 발현여부 및 정도를 분석하였으나, 이 기법이 응용되면서 글라스 막이 등장하면서 대용량 분석 및 자동화, 실험의 안정화 등을 도모하기에 이르렀다. 이는 암세포와 정상세포간의 RNA비교분서과 SNP의 다양성 분석에도 이용되어 지고 있다.

 

 

 

2. 유전체 염기서열 분석기술

 

DNA 염기서열을 분석하기위해서는

1977년 개발된 화학적 분석법과 1975년 생어애 의해 개발된 사슬종결 염기서열결정법 두가지가 있는데 화확적 분석법은 별로 사용되지 않았고, 생어의 사슬종결 염기서열법이 일반적으로 계속 사용 개발되어져 왔다.

 

 

사슬종결 염기서열 결정법

초창기에는 방사성 동위원소 사용방법에서 열순환 염기서열 결정법으로 발전하면서 전통적인 방법보다 진전된 방법(이중가닥 DNA 사용과 아주 적은양의 주형 DNA사용)이 되었고, 이후 1985년에 기존보다 3,000배나 빠른 업무 처리 공법을 개발하여 위험성과 노동 집약성을 낮춰 대량 유전체 해독이 가능하게 되어 인간 유전체 분석에 지대한 공헌을 하였고, 기법과 개발에 탁월한 방법이었다.

단점은 10kb이상의 긴 염기서열등은 분석이 어려운 문제가 있었다.

인간의 유전체 분석이 완료된 이후 염기서열에 대한 분석기법 및 컴퓨터를 이용한 생명정보학의 발달로 더욱 다양한 생명체를 대상으로 유전체의 염기서열 분석 수행되었다.

짧은 단편에서는 유용하나 긴 염기서열 해독이 어렵고, 반복부분의 부위분석에 오류가 발생하는 단점이 있는 숏건shot-gun 분석 방법의 사슬종결 염기서열 결정법의 문제를 해결하기 위해서는 유전체 지도가 먼저 제작되어야 완전한 유전체 지도 제작이 가능하다.

유전체 지도는 유전자의 위치와 다른 독특한 특징을 보여줌으로서 염기서열 결정 실험의 길잡이를 제공한다.

 

 

차세대 염기서열 분석법next generation sequencing NGS

고속과 대용량 분석에 대한 요구가 나오면서 등장한 염기서열 방법이 NGS다.

생어 염기서열분석법이 1세대분석법이라고 한다면, 2004년부터 상용화된 대용량 염기서열분석 NGS는 2세대(차세대) 염기서열 분석법이라고 할 수 있다. 초병렬 염기서열 분석법이라고도 하는 이분석법은 비용과 시간에서 획기적인 절감을 가져왔다. 생어의 사슬종결 염기서열법을 기본으로 하고 있는 NGS는 사용하는 플렛폼에 따라, 회사와 장비마다 차이가 난다.

NGS 개발 회사와 장비는 아래와 같다.

1) 파이로 시퀀싱 (pyrosequencing) -2004년 상용화

2) 일루미나 시퀀싱 (illumina sequencing) -합성기반 염기서열분석법 사용 2006년

3) SOLID 염기서열 분석법- 결합반응 염기서열 분석법 사용연결에 의해 염기서열을 해독한다는 이분석법은 2007년에 상용화됐다.

이외에도 이온 토렌토 반도체 염기서열 분석법,Heliscope 염기서열 분석법, 최근에는 DNA nanoball sequencing 등의 방법들이 있다.

 

 

 

 

DNA 분석방법

 

바이오칩(biochip)

분자생물학 분야에 사용되는 방법으로서, 작은 기판 위에 DNA나 단백질을 배열시켜 동시에 많은 양의 단백질을 분석하고 유전자의 발현이나 결함 등을 식별하는 데에 이용된다.

바이오칩에 대한 개념은 1980년 노벨상을 수상한 프레드릭 생어(Frederick Sanger)와 월터 길버트(Walter Gilbert)의 DNA 서열을 분석해내는 방법을 발견하는 것부터 시작될 수 있다. 이후 DNA 서열 분석의 화학적 과정이 전류와 결합되면서, 분자 단위의 분석이 소형화 되는 토대가 마련되었다.

또 다른 노벨상 수상자인 캐리 멀리스(Kary Mullis)가 1983년 처음 발표한 '중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)'은 생물학자들이 미세한 양의 DNA를 몇 만 배 증폭 시킬 수 있도록 하였다. 1986년 레로이 후드(Leroy Hood)에 의해 발표된 '형광 기반 DNA 염기 서열 분석' 방법은 자동화된 DNA 서열 판독이 가능하도록 하였다. 이외에도 상보적인 DNA 서열의 교접을 통해 서열을 분석하는 방법이나 유전자 표식법 등은 DNA 서열을 보다 컴팩트하고 저렴하게 분석하는 시스템을 개발하는 데에 중요한 기술적인 기반을 제공하였다. 이러한 기술들이 축적되어 1990년 초반부터 하이세크(Hyseq)와 아피메트릭스(Affymetrix) 등의 회사에서 바이오칩을 이용한 DNA 어레이 기술을 발명하기 시작했다.

 

활용

DNA 기반 바이오칩은 크게 두 분야에서 활발히 사용되고 있다.

 

1) 돌연변이 탐지

첫 번째는 특정 질병의 발병을 진단하는 마커로서, 질병을 유발하는 특정 유전자의 돌연변이를 탐지하는 데에 사용된다. 실제로 환자는 질병에 관련된 돌연변이를 탐지하기 위해 검사를 위해 필요한 조직을 기부하고 있다. 대표적인 예로는 아피메트릭스 사에서 개발한 HIV-1 프로테이즈 변이를 탐지하는 과 p53 종양 억제 유전자에서 단일 뉴클레오타이드의 이상 구조를 탐지하는 것 등이 있다. 또한 유방암 유전자, BRCA1을 탐지하는 바이오칩도 개발되고 있다.

 

2) 유전자 탐지

DNA 기반 바이오칩의 두 번째 활용 분야는 질병을 보유한 사람의 세포와 건강한 사람의 세포 내 유전자 발현 양의 차이를 탐지하는 것이다. 이러한 유전자의 발현 양의 차이를 이해하는 것은 바이오칩이 단순히 진단 도구로서의 역할뿐만 아니라 제약사들에게 있어서 병에 걸린 세포에만 존재하는 차별된 표적 지점을 알려준다. 예를 들면, 암 변이과정에서 암 유전자와 암을 유도하는 암 유도유전자는 활발한 발현을 보이겠지만 건강한 세포에서는 이러한 발현이 나타나지 않을 것이다. 따라서 이렇게 발견된 유전자를 표적으로 만들어 치료의 한 방법으로 사용될 수 있는 것이다. 하이세크 사의 은 심혈관 조직과 관련된 유전자와 중추 신경 관련 유전자, 감염성 질병과 관련된 유전자를 탐지할 수 있는 바이오칩을 보유하고 있다.

 

3) 기타

이밖에 많은 회사들이 바이오칩 위에 '작은 실험실'을 만들어 연구하고 있다. 카필러(Capiler) 사의 경우 미세유체(microfluidic) 기술을 바이오칩에 접목시켜 극소량의 액체를 칩 위에서 조작할 수 있게 하였으며, 이는 알려진 약물 표적과 약물 간의 결합을 기반으로 칩 기반 중합 효소 연쇄 반응이나 고속 대량 스크리닝(high throughput screening) 등에 활용되었다. 또한 DNA와 RNA 기반 바이오칩 외에 단백질 기반 바이오칩 역시 개발되었다.

 

생어 염기서열 분석

(Sanger sequencing)은 Applied Biosystems에 의해 처음 상용화된 DNA 시퀀싱의 한 방법으로 시험관 DNA 복제 중에 DNA사슬을 마치는 디디옥시뉴클레오티드가 DNA 중합효소에 의해 제한적으로 삽입되는 것에 기반한다. 프래드릭 생어와 동료가 1977년에 개발하여, 약 25년동안 가장 널리 쓰인 시퀀싱 방법이다. 최근에는, 많은 양의 생어 염기서열 분석은 특히 대규모, 자동 게놈 분석을 위해 "NGS" 방법으로 대체되고 있다. 그러나, 생어의 방법은 더 작은 규모의 프로젝트와 NGS 결과의 검증, 긴 연속 DNA 염기서열 분석 (> 500 뉴클레오티드)을 위하여 아직 널리 쓰이고 있다.

고전적인 사슬 종료 방법은 하나의 단일 나선 DNA 주형, 하나의 DNA 시발체(primer), DNA 중합효소, 보통의 디옥시뉴클레오시드3인산염 (dNTP), 수정된 디-디옥시뉴클레오시드3인산염(ddNTP), DNA 나선연장을 종료하는 ddNTP가 필요하다. 이런 사슬 종료 뉴클레오티드는 인산이에스테르 결합 형성에 필요한 3'-OH가 없어 수정된 ddNTP가 삽입되었을 때 DNA 중합효소가 DNA 연장하는 것을 중단하도록 한다. ddNTP는 방사성이나 형광으로 표지되어 자동 시퀀싱 기계에서 감지된다.

 

DNA 샘플은 네 가지 분리된 시퀀싱 반응을 위한 샘플로 나뉘어 네가지 표준 디옥시뉴클레오티드 (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 와 DNA 중합효소를 포함한다. 각 반응에 오직 넷 중 하나의 디디옥시뉴클레오티드 (ddATP,ddGTP,ddCTP,또는 ddTTP)가 추가되고, 나머지 추가할 뉴클레오티드는 보통의 것들이다. 이 디디옥시뉴클레오티드는 상응하는 디뉴클레오티드보다 약 100배 적은 농도로 추가되어(e.g. 0/005mM ddATP : 0.5mM dATP) 전체 염기서열이 계속 복제되는 동안 충분한 조각이 만들어지도록 한다.[1] 이것을 더 실용적으로 정돈하여, 네가지 분리된 샘플에서 모든 네가지 ddNTP를 시험하기 위해 이 과정이 필요하다. 시발체에서의 주형 DNA 연장이 여러 차례 이루어지면, 생기는 DNA 조각은 열변성되고 겔 전기 영동을 사용해서 크기별로 분리된다. 1977년의 원본 발표에서는 ssDNA의 염기쌍 고리 형성이 같은 위치를 의 란하게 하였다. 이것은 변성된 polyacrylamide-urea gel에서 각 4개의 샘플이 하나의 개별 레인에서 처리될 때 자주 일어났다. DNA 띠들은 방사능 촬영이나 UV로 보여지게 되고 DNA 염기서열은 X-ray 필름이나 겔 이미지에서 바로 읽어질 수 있다.

 

차세대 염기서열 분석

(영어: NGS, Next Generation Sequencing)은 유전체의 염기서열의 고속 분석 방법이며 High-throughput sequencing, Massive parallel sequencing 또는 Second-generation sequencing이라고도 불린다.기존 생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)과 달리 많은 수의 DNA조각을 병렬로 처리하는 데 특징이 있다.차세대 염기서열 분석의 등장으로 유전체 분석에 필요한 비용이 급격히 낮아져 많은 분야에서 다양하게 사용되고 있다.

분석 방법

1)파이로 시퀀싱(Pyrosequencing)

1996년 Pål Nyrén이 제안한 방법으로 염기서열의 길이가 늘어날 때마다 각 서열이 다른 색을 발생하게 하여 많은 DNA를 동시에 분석하는 방법이며 로체 454에 적용되었다.[6] 조각난 DNA를 라이브러리로 제작해 각 라이브러리를 일종의 기름방울 안에 넣고 증폭한다.

 

2) 일루미나 시퀀싱(illumina sequencing)

각 DNA를 유리판에 부착된 프라이머로 부터 증폭하는 방법을 이용한다. 이렇게 하면 프라이머 부근에 각 DNA 라이브러리의 복제본이 집락을 이루게 되고 이 집락을 형광 염료로 표지된 염기를 이용해 분석한다. 이 방법은 많은 양의 데이터를 얻는 것이 가능하고 오류가 적다는 장점이 있지만 분석할 수 있는 서열의 길이가 짧다는 단점이 있다.

퍼시픽 바이오 사이언스(Pacific Biosciences)에서 개발한 방법이다.

 

데이터 분석

차세대 염기서열 분석에서 나온 데이터는 이후 Assembly, Mapping, Annotation의 과정을 거쳐 분석한다

 

3) 디데옥시법[Dideoxy method]

DNA 중합효소를 사용하여 DNA의 염기서열을 분석하는 방법의 하나로, 디데옥시뉴클레오타이드(ddNTP)의 선택적 결합에 기초하여 더 이상 DNA 복제가 진행되지 못하도록 사슬종료(chain-termination)를 일으키는 방법이다.

사슬종료법(Chain termination method)이라고도 한다. 1977년 프레데릭 생어(Frederick Sanger)와 그의 동료들에 의해 개발된 디데옥시법은 차세대 시퀀싱(NGS) 방법으로 대체되기 전까지 약 25년 동안 가장 널리 사용되는 DNA 염기서열 분석 방법이었다.

 

① 원리

고전적인 디데옥시법의 재료로는 ①단일가닥 DNA, ②단일가닥 DNA로부터 새로운 DNA 사슬을 형성하는 촉매 역할을 하는 DNA 중합효소(polymerase), ③DNA 사슬을 합성할 때 필요한 전구체인 DNA 프라이머(primer), ④정상적인 디옥시뉴클레오사이드트라이포스페이트(dNTPs), ⑤DNA 가닥시 연장(elongation) 과정을 중단시키는 변형된 디데옥시뉴클레오타이드(ddNTPs)가 필요하다. 디데옥시뉴클레오타이드(ddNTP)는 두 개의 뉴클레오타이드 사이의 결합을 형성하는 데 필요한 수산화기(3'-OH)를 가지고 있지 않기 때문에, 이를 첨가하게 되면 DNA 가닥의 사슬형성이 멈추게 된다.

 

cf. 중합효소 연쇄 반응(重合酵素連鎖反應, 영어: Polymerase Chain Reaction, PCR)은 DNA의 원하는 부분을 복제·증폭시키는 분자생물학적인 기술이다. 이 기술은 사람의 게놈과 같은 매우 복잡하며 양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 또한 증폭에 필요한 시간이 2시간 정도로 짧으며, 실험 과정이 단순하고, 전자동 기계로 증폭할 수 있기 때문에, PCR과 여기서 파생한 여러가지 기술은 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에서 지극히 중요한 역할을 담당하고 있다.

 

② DNA 염기서열 분석 활용

DNA 염기서열 분석(시퀀싱)을 위해 각각의 DNA 샘플은 4개의 표준 dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 모두가 필요하고, 4개의 ddNTP(ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) 중 하나만 필요하며, DNA 중합효소가 각 반응에 첨가된다. DNA 증폭(PCR) 과정을 여러 번 거친 후에 변성된 DNA 조각들은 아가로스 젤 전기영동을 통해 각기 다른 사이즈별로 분리된다. 젤에 분리된 각각의 DNA 밴드는 자외선 또는 방사선 사진을 통해 볼 수 있고, DNA 서열은 젤 이미지나 X선 필름에서 직접 읽을 수 있다.

 

cf. 샤가프의 법칙 : 샤가프가 발견한 법칙으로 DNA의 디옥시뉴클레오티드 조성에 대한 규칙성을 나타낸 법칙이다.

cf. 어윈 샤가프[Erwin Chargaff,1905.8.11~2002.6.20]

미국의 생화학자. 크로마토그래피 방법으로 DNA의 염기를 정량적으로 분석하여 아데닌과 티민, 구아닌과 사이토신이 각각 1:1의 몰비로 들어 있다는 사실을 밝혔다.

오스트리아 출생. 1928년 빈대학교에서 박사학위를 받고, 미국으로 가서 예일대학교에서 연구하였으며, 1935년에 컬럼비아대학교 교수가 되었다. 1949년부터 크로마토그래피 방법으로 DNA의 염기를 정량적으로 분석하여 아데닌과 티민, 그리고 구아닌과 사이토신이 각각 1:1의 몰비로 들어 있다는 사실을 밝혀냈다. 이것은 1953년에 J. D. 왓슨과 F. H. C. 크릭이 X선 자료를 이용하여 DNA의 구조를 추측할 때, 수소결합에 의해 아데닌티민 및 구아닌사이토신 염기 짝지음이 일어나는 것으로 가정한 근거가 되었다.

 

cf. 프랜시스 크릭 : 영국의 분자생물학자. 1949년부터 캐번디시연구소에서 X선을 사용, 나선상단백질 분자구조를 연구하던 중 미국의 생물학자 왓슨과 킹스 칼리지의 윌킨스의 협력을 얻어 1953년 DNA의 2중나선 구조를 발표하였다. 이 밖에도 대장균의 인공돌연변이에 의한 DNA의 뉴클레오티드 배열 순서의 변화를 해석하고, 유전정보의 단위가 3개로 조합되어 있음을 예언하였다.

제임스 왓슨 : 미국의 분자생물학자. F.H.크릭과 공동연구로 DNA의 구조에 관하여 2중나선모델을 발표하였다. 1962년 크릭, M.H.F.윌킨스와 함께 DNA의 분자구조해명과 유전정보 전달에 관한 연구업적으로 노벨생리·의학상을 수상하였다.

 

cf. 허버트 하우프트만[Herbert Aaron Hauptmann,1917.2.14~2011.10.23]

미국의 생물물리학자. 'J.칼'과 함께 결정을 이루고 있는 복잡한 분자의 구조를 간편하게 알아내는 방법과 장치를 개발하였다. 이 장치에 컴퓨터를 부착하여 복잡한 X선의 회절방향과 각도를 잡아 분석 ·해석함으로써 DNA와 같은 복잡한 구조도 쉽게 알아낼 수 있게 하였다.

뉴욕시(市) 출생. 1970년 뉴욕주립대학 생물물리학 교수가 되었고, 1972년 이래 버펄로 의학재단 부총재와 연구소장직을 맡아 왔다. 미해군연구소 물질구조실험실장인 J.칼교수와 함께 ‘결정구조(結晶構造)의 직접측정방법’을 개발한 업적으로 1985년도 노벨 화학상을 공동수상하였다. 그와 칼 교수는 결정을 이루고 있는 복잡한 분자의 구조를 간편하게 알아내는 방법과 장치를 개발하였고, 최근에는 이 장치에 컴퓨터를 부착하여 복잡한 X선의 회절방향(回折方向)과 각도를 잡아 분석 ·해석함으로써 DNA와 같은 복잡한 구조도 쉽게 알아낼 수 있게 하였다. 이로써 효소 등 각종 생체화합물의 구조결정에서 이들의 구조를 바꾸어 보다 좋은 효과를 가진 물질을 얻을 수 있는 길을 열었다.

 

cf. 제롬 칼 : 미국 생물리학자. ‘결정구조의 직접측정방법’을 개발한 업적으로 노벨화학상을 수상하였다. 그의 연구는 유전공학의 발전에도 획기적인 전기를 마련하였으며 특히 최신 개발된 수백 종의 유용한 의약품을 개발하는 데 크게 공헌하였다.

 

 

 

 

 

 

* 동물유전과개량 과제

동물유전과개량 과제물. Central Dogma, DNA,RNA,단백질 분석방법. 2021 1학기 중간 과제 레포트